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            食品中呋喃妥因代謝物酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的研制

            [ 更新時(shí)間:2013-08-19 ]

             

            食品中呋喃妥因代謝物酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的研制
             
            摘要:目的 開發(fā)研制快速檢測呋喃妥因代謝物的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。方法:依據(jù)直接競爭ELISA原理,采用包被法確定最佳抗體包被濃度和酶標(biāo)抗原工作濃度、包被條件、反應(yīng)時(shí)間、底物顯色時(shí)間等,并對(duì)試劑盒的各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)進(jìn)行確認(rèn)。結(jié)果:成功的組裝了呋喃妥因的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒,并建立了肌肉、肝臟、水產(chǎn)、蜂蜜等的前處理方法,檢測限均遠(yuǎn)低于lug/kg。該試劑盒線性檢測范圍為0~4.05ng/mL,IC50浮動(dòng)范圍0.30~0.60ng/mL,樣品的板內(nèi)、批內(nèi)、批間的變異系數(shù)均小于15%,平均回收率在65%~90%之問,與其同類藥物的交叉反應(yīng)率均小于0.2%。結(jié)論:本研究研制的試刺盒重復(fù)性、再現(xiàn)性、特異性、穩(wěn)定性各項(xiàng)指標(biāo)均符合技術(shù)要求,可用于動(dòng)物源性食品中呋喃妥因代謝物殘留的檢測。
            關(guān)鍵詞:食品;呋喃妥因;酶聯(lián)免疫
            呋喃妥因(Nitrofurantoin)以及呋喃唑酮(Furazolidone)、呋喃它酮Furaltadone)、呋喃西林(Nitrofurazone)等硝基呋喃類抗生素因其廣譜、高效、廉價(jià)等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于家畜、家禽、水產(chǎn)、蜂等動(dòng)物傳染疾病的預(yù)防和治療。硝基呋喃類藥物在動(dòng)物體內(nèi)很快代謝,1一氨基一乙內(nèi)酰脲(AHD)是呋喃妥因的代謝物,其內(nèi)服后隨尿液大量排出,臨床上主要用于敏感菌所致的泌尿系統(tǒng)感染,但此類藥物及其代謝物具有很強(qiáng)的毒性,其在動(dòng)物源性食品中的殘留可以通過食物鏈傳遞給人類,長期攝入有致畸胎、致癌等副作用。美國、日本和歐盟目前已全面規(guī)定禁止使用呋喃類抗菌物質(zhì),在動(dòng)物源性食品中呋喃類殘留物的檢出限為不得檢出。我國農(nóng)業(yè)部文件農(nóng)牧發(fā)[200211號(hào)也規(guī)定動(dòng)物源性食品中呋喃唑酮、呋喃它酮的檢出限為不得檢出。
            目前用于檢測硝基呋喃類抗生素代謝物殘留的方法主要有HPLC、LC—M/MS和酶聯(lián)免疫法(EUSA)等。其中HPLC和LC—MS/MS靈敏度高、準(zhǔn)確性好,常作為藥物殘留檢測的確認(rèn)方法,在我國LC—MS/MS技術(shù)更是被作為此類藥物在動(dòng)物源性食品中檢測的國標(biāo)法。然此類方法對(duì)儀器和操作人員要求都較高,一個(gè)樣品檢測要幾百元,檢測時(shí)間也很長,不能
            滿足現(xiàn)場抽檢的需求和推廣應(yīng)用。ELISA技術(shù)以其快速、靈敏、特異性高等特點(diǎn)已成為目前藥品殘留檢測的有效方法之一。應(yīng)用酶聯(lián)免疫技術(shù)檢測硝基呋喃類抗生素及其代謝物殘
            留近幾年來取得了少許成果,Chang C等采用ELISA測定可食性動(dòng)物組織中呋喃唑酮代謝物,抑制率(Ic )可達(dá)到0.91mg/L,回收率55.8% ~99.6%;蝦類中喃唑酮代謝物殘留ELISA篩選方法。他們在酸性條件下利用2一硝基苯甲醛衍生化,乙酸乙酯提取,正己烷去雜質(zhì)后進(jìn)行ELISA分析。其最低檢測限為0.3tLg/kg,向樣品中添加濃度為0.5、1.0和3.01xg/kg 3個(gè)梯度標(biāo)準(zhǔn)品溶液時(shí),平均回收2率范圍為90.7% ~95.9%。目前,國外也已經(jīng)開發(fā)出檢測呋喃妥因等代謝物的ELISA商品化試劑盒。但其價(jià)格昂貴,價(jià)格均在4000元,盒以上。國產(chǎn)呋喃妥因殘留檢測試劑盒質(zhì)量和性能都不夠穩(wěn)定,市場化范圍qE4",。本研究擬采用酶聯(lián)免疫一步分析法,研制出可以在短時(shí)間內(nèi)大量定量分析檢測水產(chǎn)、蜂蜜、畜禽等生物樣本中AHD的試劑盒。
            1 材料和方法
            1.1 材料與儀器AHD等標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma公司,純度>99%);HRP購自美國IDS公司;TECAN Genios Basic酶標(biāo)儀;樣品稀釋工作液;ELISA試劑(包被液、封閉液、酶標(biāo)記物稀釋液、終止液、濃縮洗滌液);其它化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。
            1.2 方法
            1.2.1 AHD抗血清效價(jià)的測定呋喃妥因抗血清采購自美國IDS公司。采用直接ELISA法進(jìn)行測定。酶標(biāo)反應(yīng)板包被抗呋喃妥因抗血清、洗滌、封閉,并以同樣的稀釋度的陰性血清為對(duì)照,第1行1~12孔依次加入倍比稀釋的呋喃妥因過氧化合物酶結(jié)合物(購自美國IDS公司),均為IO0uL/孔,22~23℃溫育10min;再加入辣根過氧化物酶(ARP)底物(購自美國
            IDS公司)lO01~ld孔,經(jīng)過10min孵育,終止反應(yīng)后測定OD450值??寡宓腛D450值與相同稀釋度的陰性血清0D450值之比大于2的最大稀釋度定為呋喃妥因抗血清的效價(jià)。
            1.2.2 EUSA方法的建立   呋喃妥因抗血清的效價(jià)確定之后,依次通過對(duì)半抑制濃度(IC )值、最大吸光度值進(jìn)行比較確定最佳抗體包被濃度和酶標(biāo)抗原工作濃度、包被條件、反應(yīng)時(shí)間、底物顯色時(shí)間等。以AHD濃度( g/L)的自然對(duì)數(shù)值為x軸,百分吸光率B/BO(B為添加藥物時(shí)的吸光值,B0為不添加藥物時(shí)的吸光值)為Y軸,繪制曲線圖。
            1.2.3 AHD標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立根據(jù)1.2.2節(jié)得到的最佳ELISA方法條件,選擇合適的抗原抗體含量及不同濃度梯度的AHD標(biāo)準(zhǔn)品(O、0.05、0.15、0.45、1.35、4.05ppb)進(jìn)行一步
            法直接競爭ELISA,以AHD標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ng/mL)的自然對(duì)數(shù)值為x軸,百分吸光率B/B0為Y軸,得到線性及靈敏度較高的呋喃妥因標(biāo)準(zhǔn)曲線。
            1.2.4 樣品前處理方法的建立   對(duì)于組織(肌肉、肝臟、水產(chǎn)等)取適量供試樣用均質(zhì)器均質(zhì)樣本,避免出現(xiàn)有高脂肪、血管等物質(zhì),取1.0±0.05g的均質(zhì)物進(jìn)行以下操作;對(duì)于蜂蜜樣品直接稱取1.0±O.05g的供試樣進(jìn)行一下操作:
            (1)衍生化
            加人4mL蒸餾水,0.5mL 1M 鹽酸和150 L 50mM的4一硝基苯甲醛溶液;渦旋混勻30s,60%水浴3h,每隔1h渦旋振蕩一次。
            (2)提取
            加人5mL 0.1M 磷酸氫二鉀和0.4mL 1M氫氧化鈉溶液,混勻加入6mL乙酸乙酯,劇烈振蕩60s以上;室溫條件下,4000g離心10rain;收集3mL的上層乙酸乙酯至10mL玻璃試管(不能使用塑料管),50~60%水浴氮?dú)獯蹈伞?/span>
            (3)凈化
            加人lmL正己烷,渦旋混勻30s,然后加入lmL樣品稀釋工作液復(fù)溶,振蕩混勻30s(組織樣本此過程中一定要注意防止乳化);室溫條件下3000g離心5min完全棄去上層有機(jī)相,取下層水相取50 L用于分析。對(duì)于飼料樣品,稱取1.0±0.05g粉碎的樣本加入lOmL乙腈,65℃超聲波提取15min,室溫下4000rpm離心10min;取上清液2mL,于50~60%水浴環(huán)境中氮?dú)獯蹈桑患尤雔mL樣品稀釋工作液溶解干燥物。充分混勻后用樣品稀釋工作液再做1O倍稀釋,取50 L用于分析。
            1.2.5 試劑盒各項(xiàng)技術(shù)參數(shù)的確定
            (1) 試劑盒靈敏度實(shí)驗(yàn)
            評(píng)價(jià)競爭性酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)反應(yīng)靈敏度的方法,常用的有Ic 和檢測限(下限)。分別測定20次標(biāo)準(zhǔn)曲線的Ic,確定該值的浮動(dòng)范圍。一定條件下,試劑盒方法檢測限符合
            正態(tài)分布的規(guī)律,取肌肉、肝臟、水產(chǎn)、蜂蜜20個(gè)空白樣本通過試劑盒測定的光密度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上對(duì)應(yīng)的AHD含量的平均值(x)和標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示,檢測限=X+3S。
            (2) 試劑盒重復(fù)性和再珊I生實(shí)驗(yàn)
            重復(fù)性即實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的變異程度。以蜂蜜樣品為例,將空白樣品以定量限0.5 g/kg、兩倍定量限1 g/kg進(jìn)行添加,每個(gè)濃度各5個(gè)平行,并抽取3批試劑盒,每批試劑盒測定
            同一份樣品3次,分別計(jì)算測定樣品板內(nèi)、批內(nèi)和批間平均回收率,得到樣品的變異系數(shù)和回收率范圍。再現(xiàn)性即實(shí)驗(yàn)室間的變異程度。對(duì)同一魚肉樣品,分別在不同地點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)室對(duì)隨機(jī)抽取的同一批次的3個(gè)試劑盒進(jìn)行添加實(shí)驗(yàn),計(jì)算其平均回收率和變異系數(shù)。
            (3) 試劑盒特異性實(shí)驗(yàn)
            試劑盒的特異性可用藥物的交叉反應(yīng)率來表示。交叉反應(yīng)率即引起50%抑制的標(biāo)準(zhǔn)物濃度與類似物引起50%抑制的濃度值之比。本實(shí)驗(yàn)分別測定了該試劑盒與呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因等原型藥及其代謝物的交叉反應(yīng)率。
            (4) 試劑盒穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)
            采用冷熱性加速實(shí)驗(yàn)確定試劑盒的穩(wěn)定性。將三批試劑盒置于37℃恒溫箱中1d、3d、6d,隨機(jī)取6盒試劑盒檢測相關(guān)技術(shù)指標(biāo)。從3批試劑盒中抽出6個(gè)試劑盒,每盒均做4℃ 6個(gè)時(shí)間段(第0、1、2、3、6、7月)的保存試驗(yàn)。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別取出1個(gè)試劑盒,每個(gè)試劑盒做5條曲線、5個(gè)樣品重復(fù),測定其Ic 抑制濃度(靈敏度)、檢測限、標(biāo)準(zhǔn)品板內(nèi)變
            異系數(shù)和回收率等相關(guān)技術(shù)指標(biāo)。
            2 結(jié)果
            2.1 AHD抗血清效價(jià)的確定   經(jīng)測定AHD抗血清的效價(jià)為1000。
            2.2 AHD抗體包被濃度和酶標(biāo)抗原工作濃度的確定   通過滴定法對(duì)Ic 值、最大吸光度值和樣品添加回收率的比較,確定抗體的包被濃度和酶標(biāo)抗原的工作濃度。
            隨著包被抗AHD抗血清濃度的降低,最大吸光值降低,Ic 值在一定范圍內(nèi)也隨之降低。經(jīng)測定包被抗血清按1.50×10 倍稀釋,其Ic 濃度、回收率和吸光度值均較好。因此,選擇1.5 x 10 倍稀釋的包被抗血清進(jìn)行包被。AHD酶標(biāo)物在2.5×10 倍稀釋時(shí),最大吸光度值、IC 一直濃度和樣品測定結(jié)果均處于最佳狀態(tài)。3.0 x 10,倍稀釋時(shí),吸光度降低以及本底干擾增加。所以酶標(biāo)抗原濃度選擇以試驗(yàn)研究2500倍稀釋相對(duì)較好。
            2.3 包被條件的確定   用包被液將抗AHD抗血清稀釋至最適工作濃度,每孔100It,L,分成3組。第一組:37℃溫育lh;第二組:37。c溫育2h;第三組:4℃溫育24h。綜合3組數(shù)據(jù)結(jié)果,選擇最大吸光值較大,Ic 較低,添加回收率較高的包被條件作為試劑盒的包被條件;37%溫育2h,最大吸光值和IC 比較好,故選擇該包被條件。
            2.4 反應(yīng)時(shí)間的確定   加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液和酶標(biāo)抗原溶液后分另 擁10min,30min,60min,結(jié)果見表5。樣品與酶櫪就原與抗血清反應(yīng)時(shí)間為30min后,樣品中的AHD能充分與酶標(biāo)抗原競爭結(jié)合酶標(biāo)板上的已包被的抗血清的有效位點(diǎn),再加入底物顯色液,可以提高反應(yīng)的靈敏度并且最大吸光度值也比較好;而反應(yīng)lOmin,加人底物顯色液,其吸光值較低,易出現(xiàn)樣品測定結(jié)果不準(zhǔn)確現(xiàn)象;其次反應(yīng)60min,最大吸光值偏高。
            2.5 底物顯色時(shí)間的確定   加入底物溶液后,22 23%條件下顯色5min、10min、20min。底物液顯色時(shí)間若較短(5min),則吸光值較低,對(duì)加終止液的時(shí)間要求更短,否則會(huì)出現(xiàn)實(shí)際值與真實(shí)值直接的差異。20min,吸光度值較高,對(duì)Ic 有輕微影響,且增加了整個(gè)操作時(shí)間。顯色10min,曲線和實(shí)際樣品測定均符合要求。其吸光度值域Ic 值均較好,故選用其作為試劑盒的顯色反應(yīng)時(shí)間。
            2.6 試劑盒的組裝   經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn),成功組裝了AHD一步法ELISA試劑盒,包括:酶標(biāo)板1塊(12條X 8孔,可拆分);酶標(biāo)物1瓶(濃縮液10 X:1.2mL); 酶標(biāo)物稀釋液1瓶(13mL);樣品稀釋液5×1瓶(4OraL);清洗液10 X l瓶(50mL);顯色劑1瓶(13mL);終止液1瓶(13mL);AHD標(biāo)準(zhǔn)品6 x lmL/管(Ong/mL,0.05ng/mL,0.15 ng/mL,0.45 ng/mL,1.35 ng/mL,4.05 ng/mL);4一硝基苯甲醛75.5mg。
            2.7 試劑金各項(xiàng)技術(shù)參數(shù)的確定
            2.7.1 試劑盒靈敏度的確定統(tǒng)計(jì)Ic 二十次測定結(jié)果,Ic50 平均值為0.47ng/mL,浮動(dòng)范圍在0.30—0.60ng/mL之間。經(jīng)試驗(yàn)確定樣品中AHD代謝物最低檢出限為0.3ug/kg(組織樣品);樣本中原型藥最低檢測限為5Oug/kg(飼料)。該檢測限能滿足歐盟的1ug/kg的最低檢測限量的要求。
            2.7.2 試劑盒重復(fù)性和再現(xiàn)性的確定 對(duì)蜂蜜樣1.0 ug/kg、2.0 ug/kg兩個(gè)濃度的AHD進(jìn)行添加,測定變異系數(shù),樣品的板內(nèi)變異系數(shù)為1.7% ~9.86%之間,批內(nèi)、批間變異系數(shù)均小于15%,樣品的平均回收率在65%一90%之間。對(duì)同一魚肉樣品,分別在不同地點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)室對(duì)隨機(jī)抽取的同一批次的3個(gè)試劑盒進(jìn)行添加實(shí)驗(yàn),計(jì)算得到的加標(biāo)平均回收率分別為88%、76%和85%,板問、批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于15%,說明此試劑盒再現(xiàn)性良好。
            2.7.3 試劑盒特異性的確定   本試劑盒檢測結(jié)果顯示,AHD與其同類的呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林等及其代謝物的交叉反應(yīng)率均小于0.2%。表明該試劑盒適用于食品中呋喃
            妥因類藥物的殘留檢測,具有良好的特異性。
            2.7.4 試劑盒穩(wěn)定性的確定 冷熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:該試劑盒在37℃經(jīng)6d的保存試驗(yàn),OD值有所下降,但零標(biāo)準(zhǔn)吸光度值仍在1.0以上。Ic 均在0.30~0.60ng/mL之間,陽
            性回收率在67.7% 一102.7%;標(biāo)準(zhǔn)品板內(nèi)變異系數(shù)在15%以下。試劑盒保存條件為2—8℃ ,經(jīng)過近7個(gè)月的測定,發(fā)現(xiàn)試劑盒從生產(chǎn)之起到第6個(gè)月,各項(xiàng)指標(biāo)均符合《農(nóng)業(yè)部文件》農(nóng)醫(yī)發(fā)r[2oo5] 17號(hào)附件2試劑盒備案參考評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定。到第7個(gè)月時(shí)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)0標(biāo)準(zhǔn)吸光度值在1.4左右,陽性樣品回收率有下降趨勢但幅度不是很大。
            3 討論
            本研究針對(duì)呋喃妥因代謝物(AHD),依據(jù)一步法直接競爭性ELISA原理,在組裝試劑盒時(shí),采用棋盤法確定最佳抗體包被濃度和酶標(biāo)抗原工作濃度,選著合適的抗原抗體反應(yīng)緩沖液,從而達(dá)到了很好的競爭抑制效果。本研究建立了肌肉、肝臟、水產(chǎn)、蜂蜜等的前處理方法,檢測限均遠(yuǎn)低于lug/kg。線性檢測范圍為0~4.05ng/mL,IC50平均值浮動(dòng)范圍在0.30~0.60ng/mL之間,樣品的板內(nèi)變異系數(shù)為1.7%~9.86%之間,批內(nèi)、批間變異系數(shù)均小于15%,樣品的平均回收率在65%~90%之間,與其同類藥物的交叉反應(yīng)率均小于0.2%,重復(fù)性、再現(xiàn)性、特異性、穩(wěn)定性各項(xiàng)指標(biāo)均符合要求。
            綜上所述,本研究建立的呋喃妥因及其代謝物直接競爭ELISA檢測試劑盒各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)均符合要求,本試劑盒操作簡便、靈敏度高、穩(wěn)定性好、檢測時(shí)間短,適用于大量樣品中呋喃妥因殘留檢測的快速篩選,為食品中非法添加呋喃妥因造成的食品安全問題提供了可靠的技術(shù)保障。
             
             

            本文內(nèi)容摘自于“畜牧獸醫(yī)科技信息 試驗(yàn)研究”2012年第7期

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